天麻专题天麻伴生菌紫褐小菇原生质体遗传转

天麻GastrodiaelataBl.是一种特殊的药用异养型植物，其生长发育依赖于萌发菌和蜜环菌2种伴生真菌。天麻种子细小无胚乳，需要小菇属Mycena萌发菌诱导其萌发，萌发菌是天麻的有性繁殖中必不可少部分。

贵州中医药大学中药资源学团队在天麻绿色高效种植技术、天麻伴生菌遗传转化体系构建、天麻病害等方面开展了多项研究，经多年努力，除在天麻旧菌材的资源再利用方面取得了显著进展与成效外（详见天麻病害及菌材资源利用研究专题

系列一：天麻种植产业生态化发展的思路与建议和天麻种植旧菌材的资源再利用探索），在天麻伴生菌的遗传转化体系构建方面也取得了一定成果。以上相关的研究的成果以专栏的形式发表在《中国中药杂志》第四十七卷第九期。本文展示的是系列二：天麻伴生菌的遗传转化体系构建。

遗传转化体系是植物、动物、微生物功能基因研究的基础，是分子机制研究的基础技术手段。而天麻伴生菌缺乏遗传转化体系，严重限制了天麻与伴生菌的互作机制研究的进程。本文围绕天麻伴生菌萌发菌的遗传转化体系的构建，考察了萌发菌原生质体遗传转化体系中的酶解参数、筛选了再生培养基和抗性标记等、通过GFP示踪法初步明确萌发菌的原生质体遗传转化体系建立成功。该工作将为解析萌发菌与天麻种子共生萌发的分子机制对天麻种植技术创新具有重要的指导作用。

袁青松，安久春，王绘，徐娇，高彦平，杨阳，江维克，张进强，李良远，周涛?

(贵州中医药大学,贵州贵阳)

萌发菌是天麻伴生菌,促进天麻种子的萌发,萌发菌促进天麻种子的互作机制的解析对天麻的有性繁殖技术创新有着至关重要的作用,但是萌发菌遗传转化技术体系的缺乏限制了两者互作机制的解析。该文从原生质体酶解体系、抗性标记筛选、再生培养基筛选、瞬时转化进行等方面分析,建立萌发菌的原生质体遗传转化体系。萌发菌菌丝在复合酶酶解8h和r/min离心沉淀,原生质体的质量和数量较好;萌发菌最佳再生培养基为RMV培养基;以50mg/mL潮霉素为最佳抗性筛选标记;载体pLH-HygB-HuSHXG-GFP-HdSHXG转化进入萌发菌原生质体且GFP基因成功表达。萌发菌原生质体转化体系成果构建,为萌发菌功能基因研究奠定了基础,进而为萌发菌与天麻种子共生萌发的分子机制研究提供技术支撑。

天麻;萌发菌;原生质体;遗传转化体系

天麻GastrodiaelataBl.是兰科天麻属多年生草本植物,其干燥块茎为传统名贵中药。天麻是一种特殊的药用异养型植物,生长发育依赖于2种伴生真菌。天麻种子细小无胚乳,需要小菇属Mycena萌发菌诱导其萌发,在天麻的有性繁殖中必不可少。因此,解析萌发菌与天麻种子共生萌发的分子机制对天麻种植技术创新具有重要的指导作用。原生质体转化体系广泛在草菇、木耳等食用真菌功能基因研究中应用,极大推动了食用真菌的遗传选育研究,为相关生产的技术创新提供重要的理论指导。目前,已有学者基于转录组、蛋白组学数据开展了萌发菌与天麻种子互作机制的研究,但这些组学数据都还停留在功能预测阶段,萌发菌相关基因在天麻种子萌发中如何发挥作用功能尚未揭示,其关键因素在于没有建立萌发菌稳定的遗传转化体系。

原生质体转化体系广泛应用于植物、病原真菌、食用菌等生物体的基因功能研究,建立以原生质体为受体材料的遗传转化体系是高效研究丝状真菌基因功能的基础。迄今为止,在许多丝状真菌的食用菌中均建立了原生质体遗传转化体系,如在黄曲霉、红曲霉、稻瘟病菌、镰刀菌、草菇、侧耳中均建立了稳定、高效的原生质体遗传转化体系,为功能基因的研究奠定非常高效的研究的平台。但用于药用植物以及相关伴生真菌研究的遗传转化体系构建尚处于探索阶段。绿色荧光蛋白易表达、易观察等优点常用作标记基因用于构建遗传转化体系,本文从绿色荧光蛋白标记载体构建、原生质体酶解体系、原生质体再生体系、瞬时转化方法等进行实验和考察分析,建立萌发菌的原生质体转化体系,揭示萌发菌与天麻种子共生萌发的分子机制,为今后生产技术创新奠定重要的理论基础。

1.1菌株与质粒

萌发菌紫褐小菇SHXG(贵州中医药大学中药民族药资源研究院)、大肠杆菌DH5α(AngBiotechnologies)、pLH-HygB(华中农业大学麦类作物分子生物技术实验室)、pMD-GLOX-GFP(华中农业大学麦类作物分子生物技术实验室)。

1.2仪器与试剂

普通显微镜(BX41,日本奥林巴斯有限公司),荧光显微镜(IX73,日本奥林巴斯有限公司)。限制性内切酶(SpeⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、ApaⅠ、PacⅠ,大连宝生物工程有限公司),崩溃酶(lywallzyme,广东博沃生物科技有限公司),溶壁酶(driselase,上海源叶生物科技有限公司),mg/mL潮霉素(上海西格玛奥德里奇贸易有限公司),mg/mL新霉素(青岛生物科技公司),酵母粉(LP,赛默飞世尔科技公司),胰蛋白胨(LP,赛默飞世尔科技公司)。

1.3原生质体制备溶液

NaCl/MgSO4缓冲液(NaCl0.45g，MgSO4·7H2O12.g，蒸馏水溶解后定容到50mL,0.22μm滤膜过滤除菌),山梨醇-Tris盐酸-氯化钙缓冲液[STC,sorbitol9.g,1mol/LTris-HCl(pH7.5)μL,CaCl2·2H2O0.g,蒸馏水溶解后定容到50mL,0.22μm滤膜过滤除菌],聚乙二醇-Tris盐酸-氯化钙缓冲液[PTC,PEG25g,1mol/LTris-HCl(pH7.5)1mL,CaCl2·2H2O0.g,蒸馏水溶解后定容到50mL,0.22μm滤膜过滤除菌],细胞壁裂解混合酶液(driselase45mg,lywallzyme60mg加入到3mLNaCl/MgSO4酶解缓冲液中,28℃、r/min溶解4h,4℃、0r/min离心5min,取上清,-20℃保存备用)。

1.4原生质体再生培养基

草菇再生培养基(RMV),大球菇再生培养(RMS1),大球菇再生培养(RMS3),0.8mol·L-1蔗糖再生培养基(YTS)。

2方法

2.1载体pLH-Hygb-HuSHXG-GFP-HdSHXG构建

采用PrimerPremier5.0软件设计载体构建所需引物(表1)。将GFP基因CDS(CGFP)、GFP启动子(PGFP)、GFP终止子(TGFP),通过SOE-PCR构建GFP表达框。然后采样酶切连接方法,将菌株SHXG上游同源区(HuSHXG)、下游同源区(Hd-SHXG)、GFP表达框(GFP)连接到pLH-HygB载体上。

2.2萌发菌

SHXG原生质体的制备条件考察2层纱布过滤收集5d的SHXG菌丝,无菌水清洗1次,挑取少许菌丝置于细胞壁裂解混酶液中,r/min,28℃酶解4h和8h后显微观察酶解效果。

然后将原生质体用2层纱布过滤,4℃,0r/min离心2min去除杂质,吸取上清液转移到新的EP管中,分别用、r/min离心5min,收集原生质体,去掉上清,取μL1×STC缓冲液悬浮,显微镜计数原生质体得率。

注:加粗碱基表示酶切位点,下划线碱基表示酶切保护碱基。

2.3　萌发菌SHXG筛选标记筛选　

将培养15d的SHXG菌丝分别接种到含、80、50、30mg/mL潮霉素和新霉素的麦麸培养基,以无抗性的麦麸培养基为对照,每个平板接种5个,每种处理3个培养皿,置25℃培养箱中暗培养,观察菌丝生长情况。

2.4SHXG再生培养基的筛选

取浓度为1×CFU/mL的SHXG原生质体20μL分别加入到20mL的RMV、RMS1、RMS3、YTS再生培养基中,摇匀后每种培养基制备5个平板,置25℃培养箱中暗培养20d,统计菌落数量。

2.5瞬时转化

取质量浓度为ng/μLpLH-Hygb-HuSHXG-GFP-HdSHXG载体20μL加入等体积的2×STC缓冲液中,混匀后,加入60μL原生质体,混匀后,冰浴25min,先后加入、μL25%的PTC缓冲液混匀后,37℃放置15min,加入到10mL的RMV液体培养基中,置25℃的摇床上培养10h,置荧光显微镜下观察,以未加入pLH-Hygb-HuSHXG-GFP-HdSHXG载体的SHXG原生质体做对照。

3结果

3.1载体pLH-HygB-HuSHXG-GFP-HdSHXG构建

采用酶切连接法成功将上下游同源区片段HuSH-XG、HdSHXG及GFP构建在pLH-HygB上(图1A),通过PCR及测序分析验证pLH-HygB-HuSHXG-GFP-HdSHXG载体的构建成功(图1B~1D)。

A.载体示意图;B.HuSHXG阳性克隆PCR鉴定;C.GFP阳性克隆PCR鉴定;D.HdSHXG阳性克隆PCR鉴定;M.DL0maker;1~3.不同的克隆。

图1载体pLH-Hygb-HuSHXG-GFP-HdSHXG构建

Fig.1ConstructionofpLH-Hygb-HuSHXG-GFP-HdSHXG

3.2原生质体制备条件的考察

在28℃酶解温度下,对比酶解时间4、8h的酶解效果,发现酶解4h后产生原生质体浓度约为2.5×CFU/mL,酶解8h时,原生质体的量得到明显提高,达到9.1×CFU/mL(图2A、2B)。对比原生质体沉淀离心速度,发现r/min离心获得原生质体浓度为4.7×CFU/mL,而r/min离心获得原生质体浓度仅为0.6×CFU/mL(图2C、2D),由此可见并非离心速率越高原生质体得率越高。

A、B.酶解时间对原生质体获得影响;C、D.沉淀转数对原生质体获得影响;??P0.01。

图2萌发菌SHXG原生质体制备条件考察(x±s,n=3)

Fig.2ScreeningoftheconditionsforSHXGprotoplastpreparation(x±s,n=3)

3.3　萌发菌SHXG抗性筛选　

通过对SHXG菌在4种质量浓度潮霉素和新霉素(、80、50、30mg/mL)的麦麸培养基中生长状况的考察,发现SHXG在4种浓度的新霉素培养基中都能生长;而在30mg/mL潮霉素培养基中,SHXG生长明显受到抑制,当质量浓度达到50mg/mL以上时,SHXG菌丝完全受到抑制(图3)。该结果说明新霉素不能作为SHXG抗性筛选标记,潮霉素可以作为其抗性筛选标记,其筛选质量浓度为50mg/mL。

图3SHXG原生质体转化筛选标记筛选

Fig.3ScreeningofmarkergeneforSHXGprotoplasttransfor-mation

3.4　萌发菌SHXG再生培养基筛选　

将制备好的SHXG原生质体分别加入到RMV、RMS1、RMS3、YTS4种培养基中,摇匀,倒平板,统计SHXG再生菌落数量,RMV再生菌落最多,均值为42个,RMS1再生菌落次之,均值为29个,RMS3再生菌落,均值为22个,而YTS中无再生菌落(图4),因此筛选出RMV作为萌发菌SHXG原生质体的再生培养基。

A.不同再生培养基下菌落再生表型;B.不同再生培养基下再生菌落统计(x±s,n=5),不同小写字母表示差异显著(P0.05)。

图4SHXG原生质体再生培养基考察

Fig.4ScreeningofprotoplastregenerationmediumofSHXG

3.5　萌发菌SHXG原生质体瞬时转化　

用载体pLH-HygB-HuSHXG-GFP-HdSHXG进行SHXG原生质体的瞬时转化,在荧光显微镜下观察其转化效果,并以未转化的SHXG原生质体为对照(图5),载体转化后的原生质体中有部分发出绿色荧光，CK未见绿色荧光。说明载体pLH-HygB-HuSHXG-GFP-Hd-SHXG已经成功转化进入SHXG原生质体中。

BF.明场模式;DIC.相差模式;GFP.GFP模式;merge.GFP和相差模式叠加。

图5载体pLH-HygB-HuSHXG-GFP-HdSHXG转化的SHXG原生质体

Fig.5MycenaprotoplaststransformedwithvectorpLH-HygB-HuSHXG-GFP-HdSHXG

4　讨论

由于原生质体的数量和质量会直接影响到转化效率,其制备是萌发菌转化体系构建的关键环节。本文实验考察发现,原生质酶解8h的得率是酶解4h的3.6倍,这说明在合适的酶解时间可提高萌发菌原生质体的产率。有研究报道表明,若酶解的时间超过8h,将严重影响所得原生质体的质量,由此确定制备原生质体的最佳酶解时间为8h。此外,原生质的收集过程也会影响原生质体的质量,通过研究离心速率对原生质体得率的影响,发现离心速率越高原生质体反而越少,这可能是原生质体在高速离心时细胞膜产生了破裂。因此,本体系确定沉淀收集原生质体时离心转速r/min。

原生质体再生是建立稳定的遗传转化体系中非常重要环节,而培养基对原生质体再生具有很大的影响。本研究比较了4种再生培养基,结果表明,草菇再生培养基对萌发菌原生质体再生效果最好,主要原因是其具有合适原生质体生长的蔗糖浓度。分析发现,不同培养基的成分差异主要是蔗糖浓度不同,YTS培养基中蔗糖的质量浓度达到g/L,远远超过其他3种培养基的含量,该培养基没有再生菌落长出。蔗糖既是碳源,也是一种渗透压调节分子,过高的蔗糖浓度会导致原生质体失水死亡,因此,蔗糖浓度对原生质体的再生具有重要影响。

王文秀等研究玉米大斑病菌原生质体转化体系研究发现不同菌株的生长发育状况、菌株的细胞壁组分的差异、菌丝中黑色素的含量对酶解的效果有很大的影响。因此,在制备原生质体时要根据菌丝的幼嫩程度开展原生质体制备的条件进行优化。已有相关研究报道菌丝越幼嫩,制备形成的原生质体活力越好,并且数量也越多。在遗传转化体系后续的优化过程中,菌龄的选择也是需要进一步优化的参数。

遗传转化体系是基因功能研究的基础,本文以GFP蛋白显微可视化为检测指标,成功建立萌发菌原生质体瞬时转化体系,为萌发菌的基因功能研究奠定了良好的理论基础。

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