干货分享丨脑缺血再灌注动物模型解析

皮肤科医生彭洋 https://baijiahao.baidu.com/s?id=1705770279303693792&wfr=spider&for=pc

近年来，由于脑血管疾病具有发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高和并发症多的特点，已成为中、老年人致死和致残的主要疾病。而缺血性脑血管疾病约占全部脑血管病人的70%~80%。

因此，建立稳定的、可重复、损伤小的大鼠脑缺血再灌注模型具有极其重要的价值，将为研究人类脑缺血再灌注损伤的发病机制和寻求保护脑组织的方法提供实验依据。

脑缺血再灌注模型可分为全脑缺血再灌注和局部缺血再灌注动物模型。今天，小欧就两者的种类、制作方法和特点做了详细的分类及介绍，希望可以为正在做该类实验的科研小伙伴们提供一些帮助。

全脑缺血再灌注造模方法

全脑缺血再灌注动物模型可通过暂时性阻断脑部血管，然后进行缺血再灌注制备，也可通过颈动脉负压分流等方法制备，每个动物模型制备各有特点。

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01二血管阻断加低血压法

造模方法：

将大鼠用10%水合氯醛(mg/kg)腹腔注射麻醉,分离暴露右侧股动脉,行股动脉插管,接BL-生物机能记录系统监测动脉血压。颈正中切口,分离双侧颈总动脉及作侧颈静脉,经左侧颈静脉插管,建立给药途径,静脉注射肝素IU/kg。

经左颈静脉回抽血液,当平均动脉压达35~40mmHg(1mmHg=0.kPa)时,用微型动脉夹夹闭双侧颈总动脉,此为缺血期开始。期间经颈静脉回抽放血或静脉注射回输血液保持平均动脉压在35~40mmHg。15min缺血期后移去微型动脉夹,去除双侧颈总动脉的夹闭,回输血液,此为再灌注期。

优点：操作简便，用一次性手术即可完成，阻断完全可逆，可人为控制动物呼吸；成模效率较典型、稳定，可重复性好。可模拟临床上休克、心功能不全、脑血管严重狭窄或阻塞合并血液低灌流引起的脑循环障碍，造成不同程度的脑组织缺血损伤，对于探讨人类缺血性脑损伤的发病规律，评价抗脑缺血药物的疗效等有价值。

缺点：模型不能在淸醒动物上复制，无法硏究血管狭窄后行为学的变化；常因存在侧支循环而造成缺血不完全，部位不确定，脑缺血时限长，有时导致脑缺血后抽搐、癫病等并发症的发生，且又处于低血压状态，会干扰其他器官、组织的供血和实验结果。

02四血管法及改良的四血管法

造模方法：

大鼠颈前正中切口，分离双侧颈总动脉，套线备用。同时枕部切口(颈部前倾30°,利于手术部位的暴露)，借助手术显微镜分离暴露第一颈椎横突翼并找左右横突孔(椎动脉在人脑前从此孔下通过)，将灼热的电烙铁尖头(直径0.5mm)直接插入翼突孔，深度以2~3mm为宜，电凝双侧椎动脉，造成永久性闭塞。

也可采用钻透第一颈椎小孔的方法(即改良的四血管闭塞法)，在直视下直接烧灼双侧椎动脉，成功率几乎%。24h后用乙醚浅麻醉大鼠(也可在清醒状况下手术)，颈部常规消毒，打开颈前正中切口，将套在双侧颈总动脉下的备用线结扎，根据实验需求可阻断血液流动10~60min，松开结扎线后可实行再灌注研究。

优点：缺血完全，具有较强的可复制性；检验缺血是否成功的指标明确。

缺点：手术复杂，缺血的稳定性和成功率较差；个体差异大，术后存活率较低；被烧灼阻断的椎动脉不可再通,改变了正常的解剖结构，影响再灌注的脑血流量，造成再灌注不完全。

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03三血管阻断法

造模方法：

将大鼠用20%乌拉坦0mg/kg腹腔麻醉，经颈正中切口，分离双侧颈总动脉备用,剪去枕骨腹侧面部分颅骨，用5-0丝线结扎延髓腹侧面上的基底动脉，通过双侧颈总动脉的关闭和开放实现全脑缺血再灌流。

优点：成功率高，缺血指标的观察眀确简单；可根据实验需要，通过阻断CCA时间的长短控制脑缺血的程度。

缺点：手术难度较大，对实验者的要求较高，故可行性不高；在手术过程中对周围组织牵拉严重，在恢复血流时会受影响。

04颈动脉负压分流法

造模方法：

大鼠采用水合氯醛腹腔麻醉(mg/kg),取颈部正中切口。分离左右颈总动脉及右颈外动脉；另取左侧腹股沟部切口，分离左股静脉并置管与输液器相连，从左股静脉注入肝素(∪)后缓慢注入生理盐水。

用微动脉夹夹闭两侧颈总动脉，从右颈外动脉向近心端插入套管针至颈内动脉与颈外动脉的分叉处，取出针芯，套管接三通与注射器相连，持续抽吸颈总动脉内血液，此为脑缺血开始，抽血速度平均为0.3mL/min左右，由于大鼠在侧支循环及循环血量上的个体差异，控制抽血速度的负压以维持在使被抽血侧的颈总动脉在直视下处于塌陷状态为宜。

在抽血的同时，间断更换注射器，将抽出的血液从左股静脉持续回输，注意保持抽血速度于输入速度相等。持续抽血30分钟后停止抽吸血液，拔出套管并结扎颈外动脉，去除两侧颈总动脉上的微动脉夹，此为再灌注开始。

优点：不改变脑血管的主要解剖结构，不影响基底动脉和椎动脉的血流，脑干无明显缺血；实施再灌注后，不改变血流动力学方向，仍保持原来的生理状态。

缺点：实验的操作较为复杂，很难保证其成功率。

局灶性脑缺血再灌注造模方法

对于局灶性脑缺血模型的制备，目前比较常用的有开颅法、插线法、光化学诱导法等造成大鼠MCA血流阻断与再通，从而导致其相应灌流区域局灶性脑缺血再灌注损伤。

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01开颅法

造模方法：

多数研究选择颞下部开颅，通过电凝或丝线结扎横过嗅束外缘或内缘处的MCA，造成脑梗塞。Kader等对电凝闭塞MCA方法加以改进，闭塞MCA所有可见分支，梗塞效果更好。

优点：开颅法MCAO模型缺血效果可靠，是迄今应用最广泛的经典局灶性脑缺血模型。

缺点：开颅创伤大，脑脊液外漏，易感染，改变了脑微环境，手术难度较大和MCA闭塞后无法观察再灌注损伤效应。

02插线法

造模方法：

Koizumi于年首次报道了尼龙线插线法制作的可逆性MCAO模型，解决了局灶性脑缺血再灌注损伤研究的难题。

该模型的制备方法是将动物麻醉后仰卧固定于手术台上，采用颈部正中切口或选择右侧颈部切口，分离一侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。结扎颈总动脉、颈外动脉及其分支动脉。分离颈内动脉至鼓泡处可见其颅外分支翼腭动脉，穿线沿起点结扎分支。在颈外动脉剪一小口，将制备好的尼龙线插入颈外动脉经颈总动脉分叉处进入颈内动脉，通过MCA起始端至大脑前动脉近端(插入深度平均18.5±0.5mm)。

再灌注时外拉此尼龙线使其球端回至颈外动脉内，即可恢复MCA血供进行再灌注。若手术选择颈部旁侧手术入路，可使手术视野暴露更好，便于血管分离；并且较颈部正中切口对气管刺激小，无需再行气管造瘘，使手术相对较简单。

优点：病理检查结果显示，造模动物病变一致、稳定性好，缺血效果可靠。尤其适用于基底节缺血再灌注的病理生理机制的研究和药物治疗效果与机制的观察。

缺点：线栓造模过程是非直视下的手术，血流是否完全阻断不能即刻得。操作不小心极容易刺破血管或拔线栓时引起出血。

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03光化学诱导法

造模方法：

一般选用Wistar大鼠，麻醉后经左侧颞部入路(右侧MCA起始段的变异较大)，暴露卵圆孔上方鳞骨下份隆起，在颧弓与颞鳞骨接合处的前端2mm处开一直径为5mm的骨窗，切开硬脑膜，可见MCA近侧段跨越嗅束。

可选择MCA起始部或嗅束内侧2mm至与大脑下静脉交叉处为光照部位。应用光化冷光源仪(金属卤化物灯)进行分步照射：经股静脉注射3%的玫瑰红B(或其它光敏材料)后，立即持续照射MCA自嗅束到近大脑下静脉之间的血管部位15min(局部光照强度为0.5W/cm2)；

之后，将光源移至MCA起始部，再注入等量玫瑰红B并持续照射MCA15min，即可形成单纯MCA闭塞模型。其原理是玫瑰红B在绿色光源作用下产生并释放单态氮，使血管内皮细胞多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应而直接损伤血管内皮细胞，导致血栓形成使局部血管闭塞。

一定时间后，在光照局部滴注20μmol/L的尼莫地平20μl，2～10min后血管内血栓物质即消失，使血管再通而形成再灌注。由于血管无机械性损伤，易于再通，再灌注充分，灌流量可达%。造模时选择MCA起始端和嗅束内侧2mm至与大脑下静脉交叉处血管，进行分步照射，不仅闭塞了MCA的近侧端，而且亦阻断了由其发出的豆纹支，可导致大脑皮质及基底神经节前外侧和后分的梗塞。

优点：1、成功率高，所造成的梗塞灶比较稳定、重复性好；2、该模型梗塞形成与病理情况下因脑动脉血栓形成导致脑梗塞的发病过程较为相似，尤其适用于抗血小板、抗血栓药物和内皮细胞保护剂的研究。

缺点：但是该方法需要特殊设备，而且形成的缺血灶多因毛细血管内皮损伤所致，与临床上大血管栓塞形成的缺血区有较大差异。

04栓塞法

造模方法：

将栓塞剂(如碎血凝块、碳素颗粒、花生四烯酸盐等)注入血管，制成脑栓塞模型。将无菌干燥的血凝块研碎，制成栓子混悬液。从颈外动脉注入栓子后，结扎颈外动脉并放开总动脉，栓子冲入颈内动脉并进入MCA。

优点：不需开颅，制作简单，缺血效果可靠。且与临床栓塞性脑卒中病理过程最为相似，比较适用于溶栓治疗的观察研究，尤其选用人血凝块作为栓塞剂更具有实用意义。

缺点：由于栓子的随机性较大，无法精确预测梗塞的部位和范围大小。

吉妮欧生物实验服务1、服务项目

动物造模

动物实验检测项目

2、服务流程

1）构建模型；